細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫 細胞克隆技術 ，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。不論對于整個 生物工程技術 ，還是其中之一的 生物克隆技術 來說，細胞培養都是一個必bu可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模 克隆 。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的 多細胞 ，這是克隆技術必bu可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

1.細胞復蘇

將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中，加入37oC預熱的DMEM*培養基中（其中胎牛血清約為10%），輕輕吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

加入DMEM*培養基清洗，棄上清液。加入DMEM*培養基，輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，接種于培養皿/瓶中，在含5% CO2的細胞培養箱中培養。

2.細胞傳代

當細胞密度達到80%~90%（過早產量不足，過晚細胞狀態不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養，一般1:3至1:5細胞一代，即從細胞接種到分離再培養的一段時間，非細胞有絲分裂次數）時，去掉*培養基，用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37oC。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度）進行消化，放入細胞培養箱中約2-3min。

加入適量DMEM*培養基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM*培養基清洗，棄上清液。

加入DMEM*培養基，輕輕吹打混勻，吸取10微升進行計數，然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養箱繼續培養。

3.細胞凍存

當細胞密度達到80%~90%時，去掉*培養基，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進行消化，放入細胞培養箱中約2-3min。加入DMEM*培養基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM*培養基清洗，棄上清液。加入lml凍存液（90%胎牛血清，10% DMSO。 一般來講血清含量可以在10%-90%之間調整，凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養，另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護細胞），放入凍存管內（管內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入4oC冰箱中凍存30min，然后放入-20oC冰箱中凍存30min，再置于-80℃冰箱內過夜。

第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

細胞凍存和復蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑，會導致細胞內冰晶的產生，從而使細胞產生內源性的機械損傷，引起細胞內環境滲透壓，PH，電解質等的改變，進而促使細胞死亡。

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